PROSEDUR PENYIAPAN DAN PEMBUATAN PREPARAT BIOLOGI

PROSEDUR PENYIAPAN/PEMBUATAN PREPARAT BIOLOGI

Preparat mikroskopis biologi adalah salah satu media pembelajaran biologi yang efektif untuk membantu pemahaman mahasiswa terhadap materi biologi. Preparat biologi merupakan satu media pembelajaran yang dapat disiapkan dan langsung diamati oleh mahasiswa. Pembuatan preparat biologi yang bersifat mikroskopis membutuhkan langkah-langkah pembuatan yang prosedural, sehingga dapat dihasilkan preparat yang berkualitas dan dapat diamati langsung di bawah mikroskop.

Mengingat banyaknya metode pembuatan preparat dalam mikroteknik yang semakin berkembang, maka dalam bahasan kali ini hanya diberikan metode standar yang perlu diketahui sebagai dasar untuk pengembangan selanjutnya. Berikut akan dijelaskan prosedur penyiapan dan pembuatan preparat biologi.

SEDIAAN APUS (SMEAR)

Tujuan : Membuat sediaan olesan dari substansi berupa cairan.

Bahan : Mencit Betina, Darah, ikan, katak, cicak, burung, dan tikus; Protozoa dalam kultur, protozoa komensal.

Metode : Smear (apus) tipis

CARA KERJA

A. Menyiapkan Apusan Vagina Mencit Betina

1. Siapkan alat dan bahan yang akan di gunakan.
2. Tiap kelompok mengambil 1 ekor mencit betina yang disiapkan laboran.
3. Mengambil 1 buah cotton buds dan basahi dengan garam fisiologis.
4. Mengoleskan cotton buds yang telah dibasahi dengan garam fisiologis pada bagian vagina mencit.
5. Oleskan cairan atau lendir yang keluar dari vagina mencit ke kaca benda.
6. Tambahkan 1 tetes metilen blue dan ratakan di kaca benda.
7. Tutup kaca benda dengan deck glass.
8. Amati apusan yang di bentuk menggunakan mikroskop.
9. Bersihkan alat dan bahan yang telah di gunakan

B. Pembuatan Sediaan Sayatan Histologis Vagina dan Serviks Mencit Betina

1. Mencit dibedah pada bagian kulit abdomen,
2. Mengambil organ vagina, serviks diambil dan jaringan ikat disekitarnya juga dipotong,
3. Fiksasi minimal 48 jam dengan buffer formalin 10%.
4. Masukkan ke dalam kaset sebagai tempat penampung organ,
5. Cuci dengan cara dibilas di bawah air mengalir dengan tekanan rendah selama 15 – 20 jam.
6. Organ vagina dan serviks secara berturut-turut dimasukkan ke dalam larutan etanol 70%, selama 4x30 menit, etanol 80% selama 2x30 menit, etanol 96% selama 30 menit dan terakhir etanol absolut selama 30 menit.
7. Dilanjutkan dengan proses clearing yaitu penggantian agen dehidrasi dengan xylol dan merupakan medium antara proses dehidrasi dan embedding.
8. Organ vagina dan serviks kemudian secara berturut-turut dimasukkan ke dalam larutan xylol I selama 15 menit dan xylol II selama overnight.
9. Organ vagina dan serviks selanjutnya secara berturut-turut dimasukkan dalam larutan xylol: parafin = 1 : 1 selama 30 menit, parafin murni I, parafin II, dan parafin III masing-masing selama 60 menit. Proses ini dilakukan untuk menghilangkan xylol dari jaringan atau organ dan menggantikannya dengan parafin sehingga terbentuk blok-blok parafin.
10. Spesimen diletakkan sedemikian rupa untuk mendapatkan potongan cross section, selanjutnya dibiarkan dingin dan mengeras.
11. Spesimen dalam blok parafin dipotong dengan ketebalan 5 µm menggunakan mikrotom hingga membentuk pita. Pemotongan blok paraffin dilakukan secara seri.
12. Pita yang terbentuk disusun pada objek gelas yang sebelumnya telah diolesi albumin, dengan menggunakan waterbath. Spesimen dimasukkan ke dalam oven bersuhu 40oC – 50oC selama 12 – 15 jam.
13. Setelah dioven, preparat vagina dan serviks dimasukkan berturut-turut ke dalam larutan xylol I selama 15 menit, lalu xylol II selama 15 menit, etanol absolut, etanol 96%, etanol 80%, dan etanol 70% masing-masing selama 5 menit, larutan pewarna Harris’s hematoxylin selama 2 – 3 menit, lalu dialirkan di bawah air mengalir selama 5 menit, kemudian dimasukkan ke dalam larutan etanol asam (etanol 70% ditambahkan beberapa tetes HCl) selama 5 menit, direndam dalam akuades selama 1 menit, larutan eosin, akuades selama 5 menit, selanjutnya dimasukkan ke dalam etanol 70%, etanol 80%, etanol 96%, dan etanol absolut masing-masing 5 menit dan terakhir dimasukkan xylol I selama 10 menit, dan xylol II selama 10 menit, cover glass ditetesi entelan dan ditutupkan pada gelas obyek (Sudiana, 2005).

C. Darah

1. Ambil darah dengan spuit yang berisi heparin
2. Teteskan pada gelas obyek bersih
3. Buat apus tipis dengan bantuan gelas obyek yang lain, kemudian kering anginkan (Teteskan darah pada gelas obyek A, pasang gelas obyek B di kiri tetes darah membentuk sudut 45° dengan A, tarik gelas obyek B ke kanan sampai menyentuh tetesan darah, setelah terbentuk kapiler, dorong gelas obyek B dengan cepat ke kiri, dan apus darah pada gelas obyek A.
4. Fiksasi dengan metanol 5 menit
5. Kering anginkan
6. Warnai dengan pewarna Giemsa 3% selama 30 menit (Giemsa stock = 30%, encerkan pada saat akan dipakai).
7. Cuci dengan akuades.
8. Kering anginkan
9. Periksa dengan mikroskop perbesaran 1000x.

D. Protozoa dalam kultur atau Protozoa dalam garam fisiologis

1. Meneteskan cairan yang mengandung Protozoa pada gelas obyek
2. Periksa dengan mikroskop yang diawali dari pembesaran 10x10.
3. Goyangkan agar terbentuk lapisan tipis pada gelas obyek
4. Kering anginkan
5. Celupkan pada akuades
6. Fiksasi menggunakan alkohol 70% selama 2-3 menit
7. Warnai dengan pewarna hemaktosilin 1% dalam air 1-2 menit
8. Cuci dengan air
9. Dehidrasi dengan etanol bertingkat
10. Penjernihan dengan xilol.
11. Tutup dengan perekat entellan

SEDIAAN UTUH

Tujuan : Membuat sediaan organisme atau bagian dari organisme hewan secara utuh.
Bahan : Cacing pipih, Kutu, Bentos
Pewarna : Carmine alum, Eosin 1% dalam air.

Cara kerja
A. Cacing pipih

1. Cacing dijepit di antara 2 gelas obyek, ikat dengan karet.
2. Masukkan ke fiksatif (etanol 70% atau formalin 4%) 2 x 24 jam.
3. Lepaskan cacing dari gelas benda, fiksir lagi beberapa jam.
4. Cuci. Jika fiksatifnya etanol 10%, cuci dengan etanol 50%, lalu dengan akuades. Jika fiksatifnya formalin 4%, cuci dengan akuades
5. Warnai dengan eosin 1% akuosa 24 jam atau carmine alum 3-4 jam.
6. Cuci dengan air.
7. Dehidrasi dengan etanol bertingkat. Etanol 30%, 50%, 70%. 95%, 100%, masing-masing 15 menit.
8. Penjernihan dengan lactophenol 30 menit dan xilol 2 x 15 menit
9. Tempel pada gelas obyek dengan perekat entellan.

B. Kutu, pinjal

1. Kutu, pinjal, difiksasi dengan etanol 70% minimal 2 x 24 jam.
2. Pindahkan ke KOH 10%. Lama penyimpanan dalam KOH tergantung ketebalan kutin dari spesimen (pinjal ±6 hari, kutu ±1 hari).
3. Cuci dengan akuades
4. Dehidrasi dengan etanol 50%, 70%, 95%, 100% masing-masing 10 menit.
5. Pindahkan ke minyak cengkeh sampai tampak jernih (±15-30 menit).
6. Pindahkan ke xilol 110 menit, lalu xilol II10 menit.
7. Atur di atas gelas obyek, tutup dengan perekat entellan.

C. Bentos

1. Bentos yang sudah bersih difiksasi dengan etanol 70% minimal 24 jam.
2. Cuci dengan akuades
3. Warnai dengan eosin 1% dalam air 24 jam
4. Cuci dengan air.
5. Dehidrasi dengan etanol bertingkat, masing-masing 10 menit.
6. Penjenuhan dengan xilol 2x15 menit.
7. Letakkan pada gelas benda dan ditutup dengan entellan.

SEDIAAN IRISAN/SAYATAN TUMBUHAN SEGAR

Cara membuatnya

1. Pembuatan preparat dengan penyayatan yang berasal dari organ tubuh mikroorganisme, misalnya penampang daun, akar, atau otot. Oleh karen itu, perlu disiapkan peralatan seperti silet, object glass, kaca penutup, dan bahan pewarna. Bahan pewarna seperti lugol, biru metilen (methylene blue), dan eosin untuk memudahkan dalam mengamati objek.
2. Gunakan gabus/batang umbi kayu sebagai alat bantu mempermudah menyayat bagian tumbuhan seperti akar, Daun, atau batang. Kemudian sayat/ belahlah tengahnya.
3. Selipkan daun pada belahan gabus. Kemudian, sayatlah dengan silet setipis mungkin agar mendapatkan penampang melintang daun (jika objek yang akan diamati adalah daun).
4. Selipkan akar atau batang pada belahan gabus. Kemudian, sayatlah dengan silet setipis mungkin untuk mendapatkan penampang melintang akar/ batang (jika objek yang akan diamati adalah akar/ batang).
5. Letakkan jaringan atau objek yang akan diamati pada object glass yang telah ditetesi air. Kemudian tutup dengan kaca penutup.
6. Tambahkan setetes pewarna. Pewarna yang digunakan dapat berupa yodium, metilen biru, ataupun merkurokrom.
7. Jika cairan terlalu banyak, kurangi sedikit menggunakan kertas lensa/tisu, tetapi jangan terlalu banyak cairan yang dibuang.
8. Amati di mikroskop dengan perbesaran paling kecil.

SEDIAAN SEGAR MITOSIS TUMBUHAN

Bahan : Ujung akar bawang merah dan bawang bombai.
Metode : Remasan (squash).
Cara kerja

1. Persiapan material: umbi bawang merah ditumbuhkan di kapas lembap dan bawang bombai ditumbuhkan di dalam wadah botol yang berisis air sampai bawang mengeluarkan akar.
2. Pra-perlakuan: Ujung akar terpilih (ujung akar utuh dan berwarna putih susu) dipotong sepanjang 1-2 cm, dicuci bersih dan dimasukkan ke dalam botol /tabung film hitam yang berisi larutan 0,002 M 8-hydroxyquinolin (lalu disimpan pada suhu 20°C (lemari es) selama 3-5 jam
3. Pencucian: akar dicuci dalam air mengalir beberapa kali.
4. Fiksasi: akar setelah dicuci bersih direndam dalam larutan asam asetat 45% selama 10 menit.
5. Maserasi: akar dimasukkan ke dalam larutan maserasi berupa campuran HC1 1 N dan asam asetat 45% dengan perbandingan 3:1 kemudian diletakkan pada penangas (waterbath) pada suhu 60°C selama 1 menit.
6. Pewarnaan: akar diletakkan pada gelas arloji dengan posisi konsentris yaitu bagian ujung akar diletakkan di pusat gelas arloji, kemudian ditetesi aceto orcein dan dibiarkan selama 30 menit sambil ditutup dengan cawan petri agar pewarna tidak menguap
7. Pemencetan (squash): ujung akar dipotong ±1-2 mm, diletakkan pada gelas obyek lalu ditetesi 1-2 tetes aceto orcein baru. Kemudian spesimen diberi gelas penutup dan dilewatkan di atas lampu spiritus sambil dirasakan hangat kuku di kulit tangan. Gelas obyek diletakkan di atas kertas tissu, lalu dipukul-pukul halus dengan pensil berkaret hingga sel-sel pecah dan menyebar rata. Terakhir bahan ditekan halus dengan ibu jari lalu dihangatkan lagi.
8. Pengamatan: spesimen diamati di mikroskop pertama-tama dengan pembesaran obyetif lemah (10x) guna melihat keseluruhan sel. Setelah diperoleh sel-sel terpilih diamati dengan perbesaran kuat (40x). Preparat yang bagus akan dijadikan preparat permanen.

SEDIAAN PERMANEN MITOSIS DAN MIOSIS TUMBUHAN

Bahan : Preparat segar mitosis akar dan miosis bunga
Metode : Mc-Clintock

Cara kerja

1. Pelepasan gelas penutup: gelas obyek yang berisi preparat mitosis dan miosis direndam dalam petridish yang berisi larutan asam asetat 45%. Dengan bantuan pinset gelas obyek dipisahkan dari gelas penutupnya. Obyek (preparat) yang melekat baik pada gelas obyek maupun gelas penutup dibuat preparat permanennya
2. Dehidrasi: gelas obyek/gelas penutup direndam dalam seri campuran asam asetat glasial dan etanol absolut dengan perbandingan 1:3 dan 1:9 masing-masing selama 3 menit. Kemudian dilanjutkan dengan merendam dalam etanol absolut selama 3 menit.
3. Dealkoholisasi: preparat direndam dalam campuran larutan etanol absolut dan xilol dengan perbandingan 1:1 selama 3 menit. Kemudian dilanjutkan perendaman sebanyak 2 kali dalam xilol murni masing-masing selama 3 menit.
4. Perekatan (mounting): sediaan berupa gelas obyek yang berisi preparat ditetesi entellan, ditutup dengan gelas penutup secara hati-hati. Sedangkan sediaan berupa gelas penutup yang berisi preparat ditempelkan pada gelas obyek baru yang telah ditetesi entellan. Selanjutnya dikeringkan pada pemanas (hotplate) suhu 40°C.
5. Diberi label: pada sisi kiri gelas obyek direkatkan label.

MASERASI TUMBUHAN

Tujuan : Membuat sediaan dengan cara menghancurkan lamela tengah yang menghubungkan antara satu sel dengan sel lainnya sehingga diperoleh gambaran bentuk utuh dari sel-sel tersebut

Bahan : Batang kayu tanaman: Bauhinia sp. dan Pinus sp.
Metode : Schultze

Cara kerja

1. Kayu dipotong kecil-kecil.
2. Potongan-potongan tersebut direbus dalam larutan HNO3 pekat yang ditambah kristal KCI03 sampai berwarna putih dan lunak.
3. Selanjutnya di cuci dengan air mengalir.
4. Menghancurkan material dengan gelas pengaduk hingga sel-sel terlepas
5. Mewarnai dengan safranin 1% selama kurang lebih 24 jam
6. Cuci dengan air (material diendapkan dengan cara sentrifugasi).
7. Dehidrasi dengan etanol bertingkat: etanol 30%, 50%, 70%, 95%, 100%, selama 10 menit (dibantu dengan sentrifugasi).
8. Dealkoholisasi menggunakan campuran etanol dan xilol bertingkat dengan perbandingan 3:1, 1:1, 1:3 dan larutan xilol murni masing-masing selama 5 menit (disentrifugasi).
9. Mounting dengan media entellan atau balsam Canada selanjutnya ditutup dengan deck glass
10. Diberi label pada sisi kiri gelas obyek.

Prawasti, T.S., Sulistyaningsih, Y.C., Dorly, Juliandi, B dan Juliarni. 2014. Penuntun Praktikum Mikroteknik. Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan IPA. IPB. Bogor.